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柚苷酶应用下食品工业论文

时间：2024-05-23 22:05:11 论文范文我要投稿

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柚苷酶应用下食品工业论文

　　1柚苷酶酶活测定方法

柚苷酶应用下食品工业论文

　　1。1Davis紫外分光光度计法

　　现在多采用改良后的Davis测酶活方法，该种方法也是测定酶活应用最多的一种。但缺点是后期紫外分光光度计时会受到底物颜色的限制，柚皮苷为黄色溶液，可能影响柚皮苷含量的测定，进而使测定的酶活不准确，并且仅是对底物柚皮苷的含量测定来获得柚苷酶的酶活力大小，无法知道组成该酶的其他酶α—L—鼠李糖苷酶和β—D—葡萄糖苷酶的酶活力情况。

　　1。2高效液相色谱仪测定柚皮苷含量

　　用高效液相色谱来测定柚苷酶水解的底物柚皮苷的含量，不仅可以测定柚苷酶的酶活力，同时还可以测得α—L—鼠李糖苷酶和β—D—葡萄糖苷酶的酶活力大小，使酶活测定精确具体化，检测柚皮苷的精确度高，误差小，提高了结果的准确性，但是操作较前一种Davis法繁琐，时间延长。对于不同的柚苷酶，高效液相色谱法检测分析的实验条件不同。陈月龙在其论文中采用高效液相色谱测定酶活时的流动相选取的是甲醇、水、乙腈并采用不同梯度洗脱分离柚苷酶水解后的产物，从其结果中可看出实现了柚皮苷、柚皮素与普鲁宁的完全分离。邓媛等也采用高效液相色谱对柚苷酶活力以及普鲁宁酶活力进行测定，同时进行了酶促动力学研究，得出柚苷酶酶解的最佳条件。高效液相色谱法测定柚皮苷含量的优点是直接反映酶解作用的各种产物含量，可获得该酶所包含的各种酶的酶活力大小，方法准确直观，直接测得不同酶活力大小，缺点是操作较复杂。

　　2微生物来源柚苷酶的制备

　　2。1柚苷酶产生菌株的筛选

　　有效的微生物筛选方法可以大量节约菌株筛选的时间和成本，因此在筛选柚苷酶产生微生物的过程中选择合适的筛选方法至关重要。目前微生物的筛选方法有透明圈法、高层试管法以及定性滤纸显色法，其中高层试管法和定性滤纸法误差较大，相较而言，透明圈法操作简单，观察方便，适用于定性筛选，是目前应用较为广泛的一种筛选微生物方法。

　　2。1。1透明圈法透明圈法是指微生物分解平板培养基中溶解性较差的底物，使菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。卢建明等人研究发现将菌悬液涂布于长有菌落的培养基内，能分解柚皮苷产柚苷酶的菌落在四周就会出现一圈肉眼可见的透明圈，但是该种方法存在误差并不能有效判断菌株产柚苷酶状况。陈玲等改良了柚苷酶平板透明圈筛选模型，利用硫酸二乙酯（DES）能与培养基中未分解的底物柚苷发生黄色反应这一原理，加入一定比例的硫酸二乙酯（DES）混合液，反应后菌落周围出现了肉眼清晰可见的透明圈。这种方法加大了透明层与外围未分解培养基的颜色对比，便于观察和测量透明圈的大小，简化了检测步骤，提高了菌种筛选效率，是目前应用最为广泛的一种柚苷酶产生菌株的筛选方法。

　　2。1。2高层试管法高层试管法的原理是通过菌体在试管培养基中产酶并逐渐扩散开，分解培养基中所含柚皮苷产生的透明层来判断菌株的产酶能力大小，但是此方法也不易观察区分开透明层的界限使判断有误差。3。1。3定性滤纸显色法定性滤纸显色法是利用柚皮苷水解后不显色来区分产不产生柚苷酶分解柚皮苷，柚皮苷在培养基中既作为产酶的诱导物，又作为酶的底物在显色时作指示剂，一次性加入简化了分析的操作步骤。但是文献中采用较少，目前应用最多的仍为透明圈法，有待开发出新的高效筛选产柚苷酶微生物的方法。

　　2。2柚苷酶产生菌株的改良

　　通过传统筛选方法从自然环境中筛选的野生菌株的产酶能力一般不高，且筛选方法工作量大，效率低。因此有必要运用现代生物技术（如原生质体诱变育种、基因工程育种等）对天然菌株进行改良获得柚苷酶高产菌株，以便得到适合工业化生产的菌株，使得在工业生产中广泛应用。其中原生质体诱变育种包括物理诱变与化学诱变。

　　2。2。1物理诱变物理诱变育种技术目前已成为工业上微生物育种中最为常用和最有效的技术之一，对微生物诱变效果比较好而且应用广泛的主要有紫外线、x射线、射线和快中子等。以上诱变技术所用的设备简单、操作方便，利用这些诱变源进行单一或者复合诱变已经得到大量的高产工业微生物菌株，在工业微生物的诱变中发挥着重要的作用。陈玲等采用不同的紫外线照射时间对产酶菌株孢子进行诱变处理，得到1株摇瓶发酵单位为500U/mL的菌株，比出发菌株的产酶能力提高了近30%。物理诱变方法并不是单一因素诱变，可选择多种诱变方式复合，以获得更优良的产柚苷酶菌株。

　　2。2。2化学诱变化学诱变的优点是经济方便（只需少量的药剂和简单的设备）、具有一定的专一性，应用广泛。陈玲等用亚硝基胍（NTG）对柚苷酶生产菌出发菌株孢子进行诱变处理，得到1株摇瓶发酵单位达770。06U/mL的菌株，比出发菌株的产酶能力提高了近100%。汪钊等用硫酸二乙酯（DES）处理产柚苷酶菌株，正变率高达50%。

　　2。2。3基因重组技术基因重组技术即是将目的基因通过基因工程技术导入到受体细胞中并表达，目前已有关于α—L—鼠李糖苷酶通过埃希氏大肠杆菌克隆和表达的相关报道，Miyata将Sphingomonaspaucimobilis菌株中编码rhaM的基因进行克隆，于E。coli中成功表达，Birgisson等人从新型嗜热细菌中克隆出两种热稳定性的α—L—鼠李糖苷酶基因，分别为rhmA和rhmB，并在大肠杆菌中表达，Hashimoto等从Bacillussp。中获得rhaA和rhaB两种α—L—鼠李糖苷酶，转入大肠杆菌克隆表达。α—L—鼠李糖苷酶基因重组技术使得柚苷酶更易获得且更经济，在食品工业和制药工业将获得更大的用途。但由于柚苷酶由α—L—鼠李糖苷酶和β—D—葡萄糖苷酶组成，并不是单一的酶系，所以使得产柚苷酶微生物的基因工程育种难度较大，必须对两种酶的结构性质深入研究，掌握两种酶在应用中的相互关系，才可能构建基因工程菌直接发酵生产出柚苷酶。

　　2。3柚苷酶的发酵制备

　　柚苷酶的发酵制备方法主要是固态发酵法和液态发酵法。固态发酵是指在没有或几乎没有自由水存在情况下，在具有一定湿度的水不溶性固态基质中，进行一种或多种微生物发酵的工艺过程。相比于液态发酵，固态发酵法发酵时间更短。

　　2。3。1固态发酵研究1996年汪钊对黑曲霉ZG86进行柚苷酶固体发酵研究，得出结论当发酵培养基初始含水量为52%～65%时，可以更好的地促进菌体合成柚苷酶，使发酵周期从115h缩短至60h左右，大大减少了发酵时间，产酶活力可达15000U/g豆饼粉。Elinbaum等人研究了土曲霉CECT2663生产α—L—鼠李糖苷酶的固态发酵工艺，发现柚皮苷比鼠李糖更加适合作为生产α—L—鼠李糖苷酶的诱导物，同时证实了固态发酵法发酵时间更短。固态发酵设备投资成本较少，能源消耗低，使其对环境的污染少，并且技术简单容易操作，再加上培养基的来源广价格低使固态发酵法在生产柚苷酶方面应用范围广，它具备自动控制能力，但缺点是得到的酶活性较低，后期分离纯化困难。

　　2。3。2液态发酵研究液体发酵法是是目前工业生产柚苷酶的主要发酵方式，指的是发酵用培养基呈液态的微生物培养过程，整个发酵过程自动化程度高，不易收到污染，得到的柚苷酶在后期纯化过程较固态发酵法容易，液态发酵法可分为液体表面发酵法和液体深层发酵法，其中液体深层发酵法是目前发酵工业中普遍使用的一种方法。随着基因工程技术的飞速发展以及用于发酵生产设备的快速改进，使得以液体发酵法生产商品酶制剂的成本正在逐步下降，因此更加有利于柚苷酶的工业化生产。

　　2。3。3发酵罐高效密度发酵目前柚苷酶发酵生产技术的不成熟和制剂化工艺的缺乏，导致成品柚苷酶酶制剂价格高昂，这严重限制了柚苷酶应用技术的开发，因此建立成熟的柚苷酶规模化发酵技术和合理的制剂化工艺具有重要意义。发酵罐高效密度发酵是将每一种成熟的发酵产品从实验室研究走向工业化生产应用的必经之路的方法。丁涛等人的论文中柚苷酶以200L规模的发酵放大，并研究发现在不同发酵规模中，α—L—鼠李糖苷酶活力出现最大值的发酵时间表现出有所不同的现象，并且最高α—L—鼠李糖苷酶活力可达1091U/mL。目前关于柚苷酶液态发酵的研究主要为一些小规模范围，如摇瓶发酵和10L发酵罐的研究，涉及到柚苷酶发酵规模系统性放大的研究还报道还较少，有待进一步的研究与开发。

　　3柚苷酶在食品工业中的应用

　　柚苷酶能将柚皮苷分解成无苦味物质，故在果汁的脱苦方面起到关键酶的作用，对于柑桔加工业的发展有着十分重要的意义，社会对柚苷酶的需求越来越大，但目前柚苷酶的主要生产途径却面临着微生物发酵效率低、成本偏高等问题。同时由于高产菌株的缺乏，国内还没有大量可用于工业化生产的商品酶制剂，而在生产实践中使用进口柚苷酶将会使企业生产成本大大增加。柑桔加工过程中的脱苦难题一直是制约柑桔加工业的一大瓶颈，与此相关的技术研究和成果必将推动柑桔加工产业化发展和柑桔种植业的发展，具有十分重要的经济意义和社会意义。以下是柚苷酶在食品工业中的应用。

　　3。1果汁的脱苦

　　许多柑桔类水果已被加工成为果汁产品，但是加工过程中出现的后苦味，致使消费者在口感上难以接受，因而降低了果汁的品质，柑桔类水果的商业价值由于其自身产生的不良苦味而受到限制。酶法脱苦具有专一性强、脱苦效果好、操作简单、脱苦条件温和、脱苦效果好，对果汁中其他营养成分及风味无破坏、酶法安全可靠等优点，是目前较为理想并最具产业化应用前景的果汁脱苦方法，必将成为今后柑橘类脱苦研究的趋势。汪钊等利用黑曲霉ZG86经固态发酵得到的柚苷酶，柚苷酶加酶量16U/100ppm柚皮苷对柑橘果汁进行脱苦，苦味脱除率达90%。

　　3。2提高葡萄酒的风味

　　1994年Caldini等将真菌葡萄糖苷酶固定在固体载体上，其目的是连续作用于葡萄酒，促进风味的改善，增加酒的风味，同时也对系统的动力学行为和固定化进行了研究。研究α—L—鼠李糖苷酶的活性条件及酶学性质对于确定最佳反应条件起到重要作用，为葡萄汁和葡萄酒的生产提供糖苷酶增香调控的理论参数，从而在提高葡萄汁和葡萄酒的质量和档次上具有重要的意义

　　3。3改善饮料的香气成分和生产食品添加剂

　　柚苷酶组成酶系中的α—L—鼠李糖苷酶在食品中的应用可改善饮料的香气成分和生产食品添加剂，水解柑桔汁中的柚皮苷和柠檬苦素以去除柑桔汁中的苦味，从而使柑桔汁酸甜可口，口味宜人，原理是通过水解饮料中的类黄酮糖苷、糖甙类物质增加水果中黄烷醇物质，从而改善水果的功能特性，也是柚苷酶水解脱苦反应中的关键酶，这种水解作用在饮料中具有广泛应用，因此食品工业中可以用其改善饮料中的香气成分，包括橘子汁、绿茶、黑醋栗汁等，也可以水解橘皮苷生产甜味剂的前体物，使食品获得新的高聚物成分从而改善食品的流变特性，因而在生产食品添加剂中具有重要应用。

　　4展望

　　目前限制柚苷酶的大规模工业化应用方面存在两个问题：第一个问题是我国缺乏适合工业化生产的高产酶菌株，发展出新的高效的筛选方法目前的当务之急。第二个问题是柚苷酶的工业化生产技术在国内还存在着很多的缺陷，在工业化生产中使用的试剂或载体存在成本偏高、酶法效率低下、稳定性较差、连续操作使用的设备较复杂等缺点，这就需要我们国家进一步开发出更简便同时更适用的应用于工业上的方法，柚苷酶应用于柑桔及其他制品的脱苦与加工国外已有相关报道，但在我国柚苷酶并没有在工业生产中大规模应用，主要原因是国内尚无大规模可用于工业生产制备的商品柚苷酶出售。今后我们应加强关于柚苷酶高产菌株的选育方法以及发酵工艺的优化等基础研究工作，作为以后发展的重要方向特别要注意利用现代分子水平通过DNA基因重组技术，选育出活性高、产酶量大的优良理想菌株。

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